Illumina靶向重测序解决方案

第二篇
 

Illumina靶向重测序

解决方案

 

靶向重测序方法介绍

Illumina目前支持两种靶向重测序方法:基于杂交捕获的富集测序以及扩增子测序。在富集测序中,人们通过序列特异的杂交探针捕获感兴趣的区域;扩增子测序则利用引物介导的高度多重寡核苷酸组合来扩增和选择感兴趣的区域。富集测序能够覆盖更多的基因内容,并更全面地分析所有变异类型,这也需要更长的周转时间和更多的手工操作。扩增子测序的流程比富集测序更加经济、更加轻松,支持较少的基因内容,适用于单核苷酸变异和插入/缺失(indel)的分析。这两种高度多重的方法都实现了广泛的应用,适合遗传变异的发现、验证或筛查。

 

靶向区域大小的比较

在分析指定样本的特定突变时,靶向基因测序panel是有用的工具。重点panel包含了一组精选的基因或基因区域,它们与正在研究的疾病或表型有着已知或疑似的关联。在购买基因panel时,可挑选预设计的内容,或定制设计的内容,将感兴趣的基因组内容包含在内。

 

Illumina靶向重测

Illumina的靶向重测序流程提供了从样本到数据的完整解决方案,包括内容设计(仅限于定制panel)、文库制备、测序和数据分析。

 

靶向重测序流程

文库制备

预设计的靶向重测序panel

在分析指定基因或感兴趣区域的特定变异时,靶向重测序panel是有用的工具。预设计的panel包含了与疾病或表型相关联的重要基因或基因区域。这些内容由业界关键意见领袖选择或来自科学文献。到目前为止,使用预设计内容的最大优势是内容已接受过检验,大大节省时间和成本。这些集合只关注基因组的一部分,同样节省了数据分析的时间,并降低了数据存储的要求。对于样本筛查或发现变异,多个样本的多个基因可平行评估,与单独的反复检测相比节约了时间,并降低了成本。目前我们提供多个研究领域的预设计集合,包括癌症、隐性的小儿发作性疾病、心脏病等。

 

预设计panel的主要优势

  • 深度测序重要基因或感兴趣的区域(500-1000倍或更高),实现低频率变异的鉴定

  • 大大节约时间,因为内容是精选的,并经过检验

  • 为研究疾病相关的基因提供一种经济高效的方案

  • 带来准确且容易阐释的结果,可鉴定等位基因频率低(低至1%)的变异

  • 在单次检测中实现致病或遗传突变的可信鉴定

Illumina提供的靶向重测序Panel

文库制备试剂盒和芯片试剂盒选择器
为找到合适的文库制备试剂盒,研究人员可使用文库制备试剂盒和芯片试剂盒选择器(https://www.illumina.com/library-prep-array-kit-selector.html)。这个基于网页的交互工具提供了每一步的指引,可帮助您选择特定应用的文库制备试剂盒。这个工具是根据起始材料、起始材料的质量、感兴趣的区域、技术等来选择试剂盒的。


利用DesignStudio™软件设计定制panel

由于预设计靶向基因panel的专一性,它的内容无法覆盖每位研究人员感兴趣的所有靶标。定制测序集合实现了基因或目标内容的定制,让研究人员可以根据研究兴趣利用DesignStudio软件(https://www.illumina.com/informatics/sample-experiment-management/custom-assay-design.html)来定制。

DesignStudio软件界面

Illumina Concierge服务带来更多选择

Illumina Concierge服务为Illumina的定制靶向重测序项目提供更多的设计支持和扩展功能。例如,有了Concierge服务,一些定制的靶向重测序试剂盒,如TruSeq Custom Amplicon v1.5 Library PrepTruSeq Custom Amplicon Low Input Library Prep Kits,能够掺入独特的分子标识符,增强等位基因检测并提高灵敏度。独特的分子标识符可去除PCR重复,实现单个分子的检测和定量。TruSeq Custom Amplicon Assays也与双链测序兼容,这减少了因福尔马林固定时的脱氨基事件或其他DNA损伤而引起的假阳性。Illumina Concierge服务还能设计更小的扩增子(~100 bp),以增强与片段化DNA的兼容性,如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织。若对Illumina Concierge服务有兴趣,请联系Illumina的销售代表。

基于富集的文库制备
基于富集的文库制备是从Nextera tagmentation开始的,它将起始基因组DNA转化为带接头的文库,而不需要机械剪切。接着,将文库变性,并与针对靶向区域的生物素标记探针杂交。加入与生物素化探针相结合的链霉亲和素包被的磁珠,富集感兴趣的区域。通过生物素化探针与链霉亲和素包被的磁珠相结合的DNA片段被磁力拉下。之后从磁珠上洗脱富集的DNA片段,并开展第二轮的杂交和捕获,之后再进行测序。

 

基于富集的文库制备流程

 

基于扩增子的文库制备
扩增子测序包括两种方法,这取决于所选择的产品。第一种方法采用杂交
延伸连接,从双链DNA中产生单链模板,随后通过PCR扩增制备文库。文库制备是从杂交开始的,使用的是高度多重的寡核苷酸库。每对寡核苷酸靶定基因组中感兴趣的特定区域。在杂交之后,延伸连接反应在感兴趣的区域上延伸寡核苷酸。所产生的延伸连接模板经过PCR扩增,掺入了文库特异的索引和测序引物。利用磁珠法操作,将反应终产物转化成单链、带接头的均一化文库。之后无需任何处理,文库可立即用于测序。

第二种方法涉及到一种多重PCR方法,从基因组DNA中扩增预先确定的靶向区域。这种文库制备利用两对寡核苷酸进行多重PCR,以扩增和选择感兴趣的区域。利用索引接头,在文库上添加索引并进一步扩增,然后融入测序的制备。

基于扩增子的文库制备流程

测序技术和测序系统
在制备好文库之后,接着开展簇生成。将文库注入流动槽中,并通过流动槽表面的与接头互补的寡核苷酸捕获。通过桥式扩增,将每个文库片段扩增成不同的克隆簇。在簇生成完成后,模板可立即用于测序。

Illumina的边合成边测序(SBS)技术是世界上最成功且最广泛采用的NGS技术的核心部分。在IlluminaSBS技术中,当每个dNTP掺入时,对荧光标记的可逆终止子进行成像,随后切割以利于下一个碱基的掺入。在每个测序循环中,所有四种与可逆终止子结合的dNTP都存在,这种天然竞争最大限度地减少了掺入偏向。最终结果是以大规模并行的方式实现了真正的逐个碱基测序。到目前为止,34600多篇同行评审的文章引用了Illumina测序系统上产生的数据。

 

Illumina的测序系统具有用户友好、简单直观的界面,在每种测序规模下都能轻松地设置运行和操作。MiniSeq系统是扩增子、靶向RNA、小RNA以及靶向重测序的理想之选。MiSeq系统不但支持以上方法,还实现了小型基因组的测序。在Illumina台式测序仪产品线的所有产品中,NextSeq系列在每次运行中提供了最高产出和最多read数,实现了外显子组、转录组和靶向重测序等应用。

测序覆盖度计算器
测序覆盖度计算器(https://support.illumina.com/downloads/sequencing_coverage_calculator.html)是一个基于网页的工具,可以帮助研究人员确定让实验达到理想覆盖度所需的试剂和测序运行。根据特定应用、起始参数和所选的测序系统,计算器生成一个表格,其中包含达到理想覆盖度所需的通道或流动槽数量。结果可通过逗号分隔值(CSV)文件下载,此文件可共享或在Excel中编辑。

 

测序覆盖度计算器界面

简化的数据分析
Illumina测序系统可选择与BaseSpace® Sequence Hub连接,这是Illumina的基因组学计算环境,适用于测序数据的分析和管理。实验室可轻松、安全地存储、分析、存档和共享测序数据。通过按键式的工具,研究人员可简化和加速信息学流程。实验室也可以实时地设置和监控与BaseSpace SequenceHub连接的任何Illumina仪器的测序运行,体验从样本到结果的完整解决方案。

 

BaseSpaceSequence Hub运行界面


展望

全世界的实验室都在利用以NGS为基础的靶向重测序来审视体细胞突变和胚系突变,与桑格测序和PCR法基因分型相比,它的成本更低,周转更快,且样本起始量要求更低。通过靶向重测序,研究人员能够将他们的时间、经费和数据存储资源集中在基因组中最具影响力的区域。靶向重测序评估一组预先设定的目标区域,因此它实现了深度测序,并带来了更高的灵敏度,可以检出低频率的变异。预设计的靶向重测序集合特有专家精选的内容,让研究人员不必花时间和经费来设计和检验他们自己的panel,便于快速采用。靶向重测序是一种强大的工具,可帮助研究人员了解复杂疾病的发病机理,确定重要经济作物的抗病基因,有朝一日,它也许能为子孙后代带来更加有效的治疗方案。

 

欲了解更多信息,请扫码下载原文

 

测序百家,转转请注明出处:https://www.ngsgo.com/archives/2394.html

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

联系我们

邮件:admin@ngsgo.com

工作时间:周一至周五,9:30-18:30,节假日休息