2017年Nanopore科研团体大会:会议第一日资讯

Nanopore科研团体大会第一日圆满结束,如果您没能亲自到场,可以通过关注推特上的话题

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全体会议

伯明翰大学Nick Loman

伯明翰大学微生物学及感染理学院教授Nick Loman是本次大会全体议程的开场演讲嘉宾。Loman教授的研究方向是微生物基因组学与生物信息学。在演讲中,他阐发了“测序奇点”这一概念。“测序奇点”指的是这样一种情况:未来,大量的诊断测试能够被一种单独的测序检测所取代。这种测序将针对致病菌检测、AMR表达水平、感染源头、感染爆发追踪及宿主对感染和治疗的反应进行检测。Loman教授回顾了纳米孔测序近期的新发展,其中包括他的团队在病毒与细菌诊断性测序、实时监控、RNA与人类全基因组测序中取得的成果。

Loman教授介绍了他的团队2013年到2016年间在西非地区对埃博拉疫情进行追踪研究的工作。2015年在几内亚,他的团队利用MinION开展研究项目,快速洞悉病毒传播,从而促进了疫情爆发管理工作的水平。 MinION可以被装在一个小型的行李箱里进行运输并在现场简易安装运行,在短短几天内得出实时数据结果。通过纳米孔测序得出的数据,该团队发现埃博拉病毒常常在一个国家内部或国与国之间远距离传播。该团队进一步发现,新的埃博拉病毒可以通过之前感染后存活的宿主迅速传播造成爆发,而不是之前认为的通过动物群体。其中一个例子是,自初次感染500天后,埃博拉病毒经由一个感染存活宿主得到传播,引起了新一轮的感染数猛增。

Loman教授认为,未来,像这样的可携带、实时测序技术将能防止感染的爆发演变成大规模的疫情。为了进一步完善基础工作而让这样的信念成为现实,他的团队把埃博拉病毒研究中的发现应用到了巴西寨卡病毒爆发的相关工作中。与埃博拉病毒不同的是,寨卡病毒的临床试验样本病毒滴度较低,因此,标准化的宏基因测序将无法得出令人满意的结果。

为了解决这一问题,该团队开发了一种新的tiling PCR技术来测序基因组,从而更有效率地追踪寨卡病毒在美洲地区的传播。该项数据显示,对寨卡病毒感染的首次临床诊断是在病毒在该地区开始流行后超过一年的时间之后做出的,这说明了现有的病毒监控技术的局限性。

Loman教授又把注意力转向了临床致病菌检测的测序应用上。他相信,测序将会重新定义并取代现有的临床操作。与此同时,他也提出了一些现存的挑战,包括对信息学和实验室工作流程的简化。他的团队正在努力解决这些问题。Loman教授也介绍了他的团队的一些近期工作:通过快速建库流程,他们成功的将原有的样本准备时间减半到大约4个小时。

Loman教授的团队正在努力解决的另一个问题是,如何确保检测能够应用于多种病菌并与此同时解决大多数临床样本中高宿主DNA含量的问题。

演讲结束时, Loman教授向加文医学研究所(Garvan Institute for Medical Research)的Martin Smith表达了祝贺。该研究所最近取得了970 kb的纳米孔测序最长读长。 但是,他自己研究团队还保持着一个记录:用8个超长reads测序一个完整的大肠杆菌基因组,其中组装时长仅需1.5秒。基于这一点,Loman教授提出了这样一个问题:“基因组组装概念是不是快要结束了?”

全体会议

Oxford Nanopre公司Sissel Juul

纳米孔DNA, cDNA 和直接RNA测序在基因学和基因组学中的应用Oxford Nanopre Technologies公司基因组应用主管Sissel Juul在演讲开篇介绍了公司应用研究团队的科学会议海报(可在此在线查看),包括:

  • 全自动制库设备VolTRAX系统(目前在早期用户阶段)的进展。2018年的第二版本将会拥有PCR,DNA量化及基于少量细胞的全基因组扩增(WGA);

  • 比较了基于1D和1D2测序的基因组从头组装:1D2比1D生成了更连续的组装。在读长比较短时,这一区别更加明显;

  • 使用纳米孔测序对来自包括泥土的复杂样本进行细菌基因组组装。结果显示,即使是在全组装无法实现的情况下,这种方法仍能够提供真对复杂生物样本的颇有价值的分类和功能信息。

Sissel介绍了团队用Oxford Nanopore的MinION测序系统,通过进行胚胎植入前遗传学筛查(PGS),检测染色体数目畸变及增加的潜在流产风险。与CARE生殖健康公司(Care Fertiliy)的Simon Fishel合作,Sissel介绍了如何通过上游全基因组扩增和纳米孔测序进行非整倍体检测。同时,targeted PCR也可以检测ANXA5 M2单倍型(一个已知能够增加重复性流产风险的基因标识)。在取卵(egg collection)后短时间内,通过筛查囊胚活检,整个流程的时间与成本都能极大地降低,同时维持流程的控制水平。更进一步来说,这两个检测可以同时进行。方法是在已扩增的WGA扩增物上进行一个较低cycle的PCR反应,对ANXA5 M2目标扩增。 在灵敏度检测中,通过约25Mb的低测序覆盖度就能非常成功地对非整倍体进行检测。在450bp每秒的测序速度下,利用MinION测序生成结果的时间少于5分钟。

癌症中的结构变异是演讲的下一个话题。Sissel介绍,利用纳米孔测序的长读长特点,可以检测大量的染色体内和染色体间重排。在15到19.5X的测序覆盖度下对两种癌症细胞进行测序,从测序数据中可以清晰地看到KRAS基因中已知的非同义变异。这些结果显示,长读长纳米孔测序可以成功地用于对肿瘤基因组DNA的分析,并在确认结构变异方面比核型分析有更高的分辨率。

在RNA测序方面,Sissel介绍了今年由Oxford Nanopore公司推出的三种试剂盒。Sissel说,RNA直接测序、PCR cDNA测序和无PCR的cDNA测序中的GC含量偏好性(GC content bias)和读长偏好性(read length bias)都是可忽略的。根据一张科学会议海报上的内容,要成功检测出同样数量并完全覆盖的(大于95%)转录本,纳米孔测序比短读长技术所需的读数少50倍,所需的碱基少7倍。之后,无PCR的cDNA测序方法被用于大肠杆菌在不同增长情况下的比较转录组学研究,展现了两种情况下的差异化基因组表达。

演讲中也提到了长链非编码RNA(lncRNA)。Sissel展示并介绍了一项针对一组特定lncRNA的研究。这些lncRNA的表征结果差强人意,并被认为具有能够杀死癌症的表型。这组lncRNA转录本中只有一小部分的保守区域是已知的。因此,研究人员设计了一组半特异性PCR分别识别lncRNA的 5’和3’两端。 该研究发现了大量完整、前所未见的异构体。

在演讲的最后一个环节,Sissel介绍了由Oxford Nanopore公司开发的新技术,用于检测DNA和RNA中被修饰的核苷酸。利用新推出的Tombo修饰碱基检测算法,研究人员用新模型分析了含有修饰碱基的基因组数据,并在其中检测出了一个二级信号级别的移位(secondary signal level shift)。

作为演讲的总结,Sissel探讨了现在和未来MinION使用者可选择的应用,其中包括了基因组相关应用,如取证工作、水质检测、面向消费者的基因检测、生物防御、细胞鉴定、食品安全等,不胜枚举。

RNA/cDNA分组会议

通过RNA直接测序的转录组分析—Intawat Nookaew

阿肯色大学生物医药信息学系的Intawat Nookaew教授在演讲中谈到了如何利用Oxford Nanopore公司的长读长技术解决与测序基因组DNA重复区域相关的问题。

 

Nookaew教授介绍,利用RNA直接测序可以在酵母菌的生长基质从葡萄糖转化为乳糖的过程中确定基因表达模式。在不同的生长条件和阶段下,相同的样本呈现了截然不同的基因表达谱并在排序图上呈现基于实验条件的聚类。这清楚地证明,标准的差异基因表达分析可以被应用在Oxford Nanopore Technology公司的RNA数据上。进一步来说,通过PIANO完成的的基因簇分析突出了与每个实验组有较强相关性的特定基因。把乙醇当做生长基质的微生物中,与乙醇代谢相关的基因有高倍数增长。同时,葡萄糖组中上调表达的基因则与快速的生长过程相关。

在与不同的RNA测序方法的比较中,0.5Gb的RNA直接测序生成的结果与其他1Gb读数的短读长测序技术生成的结果相当。现有更进一步的证据证明,长读长的纳米孔测序中GC偏好性也较低。

作为演讲的总结,Intawat讨论了针对包括不成熟的mDNA、双重转录和非编码RNA等转录结构分子的研究方法。

利用MinION纳米孔测序仪对流感病毒RNA进行RNA直接测序—Matt Keller

乔治亚大学的Matt Keller在演讲中介绍了对季节性流感A的RNA直接测序。在演讲的开篇,他描述了这一病毒对健康的影响:每年会感染一百万人,导致他们必须入院治疗。由于这种微生物具有负链RNA基因组,Matt认为,这一特点使其成为了一个通过纳米孔平台进行RNA直接测序的完美案例。

为了连接RNA直接测序接头和病毒RNA,Matt利用基因组中两个保守区域设计了与这些区域连接的接头。

在蛋壳中的尿囊液体里培养的病毒体被两种分离的方法提纯,在Oxford Nanopore测序平台和MiSeq平台上作为模板,分别进行RNA直接测序和短读长cDNA测序。第一种提纯方法是一种长时间超速离心法,生成了一个提纯水平非常高的样本;第二种提纯方法则采用了快速离心法,生成了一个无细胞碎片的不纯样本。

Matt介绍,尽管短读长数据生成了低错误率的cDNA reads,但纳米孔RNA直接测序数据生成的reads能够覆盖整个病毒基因组。而且,这种技术是直接测序研究所关注的RNA分子,而不是一个合成的拷贝(cDNA)。尽管平均读数错误率相对较高,但Matt认为,技术的进步能解决这些问题。

纯样本和不纯样本的制库都成功生成了共有序列(consensus)精确率分别为99%和98.7%的RNA序列。同时,比对至流感病毒基因组的RNA直接测序reads比例则超过了95%。作为演讲的总结,Matt讨论了在这一领域中RNA直接测序的潜在问题,其中包括修饰碱基的检测问题。

利用MinION测序系统的RNA测序盒数据分析— Stéphane Le Crom

巴黎第六大学IBENS基因组核心研究所所长Stéphane Le Crom教授,该研究所为高通量基因组学,尤其是功能基因组相关项目的研究人员提供测序服务。

Stéphane和他的团队提供从实验设计到数据分析的全面支持。他们开发了一系列支持软件包来实现目标。其中,ToulingQC是一个用于评估纳米孔RNA测序和条形码识别(demultiplexing)的质量控制软件包。Stéphane和他的团队发现,条形码对整个RNA直接测序的通量并没有可见影响。

 

接触这种新技术(direct RNA)后,Stéphane和他的团队利用一个阻断髓磷脂小鼠基因敲除模型来检验这种技术,并将基因表达与野生型的表型作出比较。在这个模型下,使用Minimap2, MinION cDNA和NextSeq cDNA reads被分别比对到小鼠参考转录组上。这两组数据显示了强相关性。在纳米孔数据检测到的6551个差异化表达基因中,86%与NextSeq数据组相呼应。有趣的是,纳米孔cDNA测序成功检测出了来自TMP3的新型的转录同源异构体(isoforms),这些同源异构体在短读长测序中无法被检测。进一步来说,较低的reads数(100k)可用于成功检测基因表达差异。

Stéphane和他的团队是新PCR cDNA试剂盒的早期使用者,他们迅速地用来自一个酵母菌样本的750万读数打破了自己的读数记录,并在一个ERCC外参混合样本(spike in control mix)中获得了接近1000万的读数。通过使用他们自己的“真实”样本,该团队持续生成高读数结果。通过使用这项新技术,并结合他们自主开发的软件,IBENS的目标是提供基于纳米孔技术的RNA测序流程,实现一体化的基因表达分析。

“Squiggle”细胞测序—Marin Smith

来自澳大利亚加文医学研究所(THE Garvan Institute)的Martin Smith介绍了利用Oxford Nanopore公司的长读长技术对单细胞进行测序的方法。 Marin在演讲开始时解释了通过Chromium 10X平台进行单细胞测序的方法:单细胞通过器械分离,并在cDNA生成阶段加入特定基因条形码。这是为了在许多细胞同时进行cDNA测序时,确认每一个转录来源的细胞。

为了成功进行单细胞转录组工作, 解编(demultiplexing)的精确性非常重要。Martin称“……(这一过程中)基础(源)数据中不存在固有误差”。他表示,只要临近序列在 “碱基” (base)空间中已知,那么精确的条形码检测就可以在“事件(event)”或“(折线)squiggle”空间中进行。Matin介绍, cDNA分子中的polyA序列和PCR引物序列能够在碱基识别数据中被找到。之后,通过掌握这些区域在重合的event空间的位置,可以实现在 event空间识别单细胞条形码。通过非监督聚类方法,被识别出的条形码events可以被集合在一起,从而确定细胞的来源。

Martin接下来介绍了一个可以用来识别标准nanopore 条形码的相似方法。尽管它的表现不如Albacore令人满意,但Martin认为,这对筛选被Albocore拒绝的“未分类”条形码来说是一种很有用的方法,可以用于挽救那些有较好Q值的数据。

比较了两种条形码识别方法:基本文本搜索和他提出的“squiggle细胞测序”法,Martin发现后者对条形码的识别率远高于前者。

基因组完善分组会议

Ryan Wick

来自墨尔本大学的Ryan Wick演讲的关注点是微生物基因组装。Ryan说,有些时候,人们把组装看做一个“已得到解决的问题”。但是,由于长读长的出现解决了一些与短读长组装数据相关的问题,组装还有很大的进步空间。

以达成完美的组装为目标,Ryan介绍了目前可能会造成组装失败的因素,探索了深层次的原因,并针对每一个原因提出了解决方案。

以克雷伯氏肺炎菌的组装为例,Ryan解释道,组装的不同阶段会导致不同的完成程度。初始的fastq组装给出的精确度是99.5%,通过使用nanopolish,可以提升精确度至99.7%,考虑甲基化的nanopolish则可以将精确度提高到99.9%。

Ryan接下来说,短reads修正可以帮助解决许多的问题——但仅限于非重复区域。通过几个例子,Ryan说明了重复区域对组装的严重干扰:在许多情况下可能导致组装失败,如一系列无法辨明的串联重复等问题。

除此之外,还有一些情况下组装失败的原因不明。由于一些数据组只能通过一种方法组装而不适用于其他方法,研究者需要找出不同组装方法的缺陷。Ryan解释说,在有些情况下,组装工具需要对一些问题作出决定,但这个决定并不明确。比如以下问题:如果孤立样本中出现变化怎么办?如果样本中有两个相似度达70%的质粒怎么办?基因组装方法时应该遵循多数原则,分离组装,还是应该把变化用图表示出来?

演讲的最后,Ryan讨论了为何研究者总是需要更长的读长和更智能的组装方法,这些问题在许多领域都存在,如多元性很高的癌细胞样本。许多杰出的研究人员都在积极地解决这些问题,因此,我们会不断地看到进步。

在总结阶段,Ryan告诉听众,他会在午餐后的数据分析工具分组会议上展示他的细菌基因组组装流程,包括Albacore, Porechop, Unicycler, Filtlong, Bandage。

Conrad Stack

来自玛氏食品的Conrad Stack探讨了纳米孔测序在构建植物参照基因组中的应用。Conrad对纳米孔技术表示了肯定。他和他的团队对预测大小为442Mb的“Pound 7”可可杂合克隆样本进行了测序,并生成了高质量的参照基因组。

Conrad团队的目标主要是对10个T可可和相关可可属物种的祖先组的基因组多样性进行表征,同时建立一个高质量的参照基因组,从而比较不同程度的修正/完成度,并确定在复杂的杂合体QTL位点上的解析度。

Conrad认为,过去使用BAC测序的组装工作花了超过两年的时间才得以完成,显示了具有复杂结构变异的活跃转座子区域。将这些BAC测序生成的单倍型与MinION contigs比较,结果显示,纳米孔测序能够基本完整捕捉这些异常复杂的重复区域。Conrad也介绍说,其他HiC和scaffolding 数据可能能够帮助进一步解析植物基因组中常见的高复杂度区域。

这一参照基因组的估计成本小于5000美元,并被与2010,2013和2017年的一些其他参考组装进行比较。2010年的第一次组装中含有超过25000个contigs,但Conrad的团队最近的成果仅有约1000个contigs。

作为演讲的总结,Conrad将他工作中见到的好坏与麻烦一并介绍。他认为,产生高覆盖度的植物基因组数据及通过组装修正来产生最佳组装都还面临挑战。但是,在低成本的前提下,纳米孔测序能够轻松地对复杂的结构变异进行解析并生成基于细胞器基因组的single contigs,这对基因组学引领下的植物繁育研究有重大意义。

结构变异分组会议

Chia-Lin Wei

美国杰克逊实验室基因组技术部主任Chia-Lin Wei分享了她的团队利用纳米孔测序来理解癌症中基因变异的经验。基因变异是癌症基因组中普遍存在的特征。然而,利用传统测序技术生成的短读长数据来分析这些基因组重排是极端困难的。然而,10至50kb的读长却可以大大降低所需要的测序深度。Chia-Lin的团队将纳米孔测序与他们自主建立的”Picky”分析流程相结合,最大化地利用了长读长的优势,对乳腺癌模型中的结构变异进行表征。这些结构变异包括串联重复、缺失和易位等。通过跨断裂点的PCR,所有由两个或两个以上reads支持的断裂点均被成功验证 。Chia-Lin说,她的团队利用中等的测序覆盖度“识别出了完整的结构变异图谱,这一实践与短读长分析相比显示出的超高的特异性与灵敏度,并向我们揭示,重复DNA是变异的主要源头。”

单核苷酸分辨率分析揭示了micro-insertions是与结构变异断点相关的一种常见的结构。断裂点在基因组中的密度与染色体间联系性和转录调控的倾向度有关。Chia-Lin认为:“使用实时、长读长测序来来表征癌症中的结构变异将对有助于监测肿瘤演变中基因组的稳定性,同时也能提高治疗干预的水平。”

Joseph Schacherer

斯特拉斯堡大学基因与基因组学教授Joseph Schacherer阐述了全面的基因组变异图谱对于研究基因组演变及其表型后果的重要性。在人类基因中,很大一部分表型变异不能从已知的基因变异型中得到揭示。这种“消失的变异”可能与用于许多基因组测序项目的传统短读长测序技术的局限性相关:短读长测序无法精确对结构变异进行表征(如序列的插入与删除、倒位和易位等)。

为了克服这些问题,Schacherer教授的团队正有效地利用MinION,通过它的超长读长,对大型的结构变异(SV)和重复区域进行测序。Schacherer教授告诉现场听众,在20x的平均覆盖度下,MinION能够完成酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和酒香酵母(Dekkera bruxellensi)的高度完整、连续的基因组组装。由于具有广泛的基因和表型多样性,酵母菌是非常强大的模型系统,可以帮助科学家理解群体基因组学。在Schacherer看来,SMARETdenovo被证明是最有效率的基因组装方法。然而,Schacherer教授建议研究人员尝试多种不同的方法来找到最适合自身实验条件的解决方案。通过高质量的组装能够精确地检测结构变异,并对其表征。Schacherer教授的团队现在可以更进一步,为这两个基因组中的转座子提供一个完整的图谱。

该团队计划将初始研究中的经验运用到更多的研究中。作为演讲的总结,Schacherer教授说道:“初步结果清晰的显示,MinION系统在测序酵母属全基因组中复杂的结构变异和基因组深度结构表征方面非常有价值”。

Svetlana Madjunkova

CReATe 生殖医学中心的Svetlana Madjunkova展示了针对纳米孔测序在胚胎植入前基因诊断(PGD)中潜在可用性的评估数据。PGS技术利用于筛查体外受精胚胎中有害的染色体重排的潜在风险,从而选择整倍体的平衡胚胎进行植入。这一技术广泛地被应用于已知染色体重组的携带者身上。这些携带者往往有更高的不育风险。

在演讲的开始,Svetlana说,我们正处于生殖健康科学的新世纪,因为通过像aCGH和NGS这样的高通量基因分析工具正不断地驱动像植入前基因筛查(PGS)和植入前基因诊断(PGD)这样的新技术的出现。然而,进步的空间还很大,因为这些工具往往受他们自身检测平衡易位的能力的限制。尽管短读长测序能够检测平衡易位,但所花费的时间、成本和所需资源都令人望而却步。Svetlana表示,纳米孔测序的超长读长对PGD技术来说是非常有吸引力的。

CReATe团队针对利用MinION开展的PGS建立了一个测序流程和一个生物信息学流程,从而精确地在5对夫妇中携带者的基因中确定了平衡易位的基因断裂点。基于测序数据,每一个基因易位的基因断裂点PCR检测都可以被定制,从而实现了对21个来自这些夫妇的胚胎进行高灵敏度检测。

Svetlana总结道:“MinION长读长测序是一个新兴的解决方案,为针对包括平衡易位携带者在内的染色体重排的高分辨率临床植入前基因诊断提供助力。”

启发性讨论

Rachel Rubinstein

第一位启发性讨论的发言嘉宾是来自银杏生物技术公司(Ginkgo Bioworks)的Rachel Rubinstein。她展示了通过MinION和“What’s In My Pot” (WIMP)工作流程来快速识别一种工业发酵中细菌污染的工作经验。她指出了现存的工作方式,如传统的短读长测序技术中的缺陷:花费太多的时间,不能达到工业发酵相关工作的需求。与之形成鲜明对比的是,纳米孔测序的实时测序能力能够在收到试验样品的8小时内识别工业发酵过程中出现的细菌污染。如此高速的周转时间使人们能够迅速的作出决定性的举措来保护工业发酵产品,从而为相关组织节省约$100,000的成本。Rachel认为,未来这样的技术能够被用于对工业发酵进行实时监控。

Jeffrey Rosenfeld

来自新泽西州罗格斯癌症研究所的Jeffrey Rosenfeld 展示了利用长读长测序技术对肿瘤DNA进行表征的数据。在乳腺癌中,HER2扩增子扮演着重要的角色,而这一角色或许尚未得到完整的认识。目前已知HER2扩增子的基因拷贝数呈增加趋势,但这些经过复制和潜在重排的基因的具体的组织方式很难利用传统的短读长技术表征。Jeffrey展示了通过纳米孔测序确认这些基因结构的数据。尽管其中还有一些数据缺口,他的团队正积极计划予以解决。这些缺口似乎与GC含量较高和较低的区域一致,因此,该团队目前的目标是尽量尝试不同的捕捉策略或低覆盖率的全基因组测序来探索这一问题。

Jeffrey说:“随着通量的增加,捕捉或靶向测序的所带来的好处将被其高成本所掩盖。”

Sebastien Theuns

来自根特大学的Sebastien Theuns介绍了纳米孔测序为动物健康管理中病毒性肠道疾病研究提供的崭新视野。他介绍说,在幼猪的粪便中不断发现新型病毒,这更加体现了目前对更好的诊断监测和相关工具的迫切需求。他的团队通过对未放大的DNA进行宏基因组学方法的研究,检测出了一种先前在比利时牲畜中从未出现的kobuvirus病毒。利用MinION,该团队仅用了7秒钟时间就识别了该病毒。Sebastien报告说,进一步对感染农场的监测已经在进行中。他将MinION称作“一个在猪肠道疾病诊断中非常有用的工具”。作为演讲的总结,他说道:“我们真诚地相信,这一技术将会为整个诊断市场带来革新。”

Sarah Stahl

日前公布的数据显示,MinION已经在国际空间站(ISS)中成功得到使用。来自美国国家航空航天局林顿·约翰逊太空中心的Sarah Stahl分享了关于第一次在太空中进行的完整测序(从采样到测序结果)流程的最新信息。在一项概念验证研究中,研究者对一个模拟微生物群落进行了测序,其中包括了所有样本处理步骤,包括DNA放大和制库。这一测序全部在国际空间站中完成。在实验得出成功结果后,该团队更进一步,对在国际空间站中配置和采样的微生物进行了16S测序。MinION快速地在物种级别上识别了这些微生物,这说明了这一工作流程能够运用于太空任务中的环境监测工作中。对回样进行的生物化学分析和桑格测序得出了与在国际空间站测序一样的结果。Sarah评价道:“这对微生物学来说是一个巨大的里程碑。我们为能在国际空间站的研究和其他领域中继续使用纳米孔技术感到激动。在太空飞行环境中对DNA的制库和测序能力将为太空环境中的研究和太空飞行中的医疗工作带来革命性的革新。”

Chang Liu

来自圣路易斯华盛顿大学的Chang Liu展示了他的研究:利用纳米孔测序对人类白细胞抗原(HLA)基因进行高分辨率分型。HLA基因是人类基因组中最多态的;对这些基因的精确分型对成功、长期的器官与干细胞移植有至关重要的意义。在之前的会议中,Chang展示了他的实验数据,显示纳米孔2D读数能在仅仅50读数内对HLA进行精确分型。在这次演讲中,他展示了1D读数在HLA分型中的可行性。他进一步解释了纳米孔测序的长读长如何能够直接给出等位基因测的分型信息,这一点目前通过短读长测序是无法达成的。Chang还介绍了他的多重PCR方法,用来放大全长基因或一系列HLA位点上的关键外显子,结合基因条形码,能够进一步节省成本。Chang表示,这些结果显示,纳米孔测序技术在HLA分型中前景光明。

Devin Drown

启发性讨论的最后一位演讲嘉宾是来自阿拉斯加大学费尔班克斯分校的Devin Drown。他展示了最新的研究成果:利用纳米孔测序揭示永久冻土中微生物的天然抗生素抗药性。Devin用警告性的语气介绍说,在过去的50年间,北极的变暖速度比全世界的整体速度快了两倍。气候变化正解冻着永久冻土,带有天然抗生素抗药性的古代微生物有可能会被释放出来,并有可能对人类和动物的健康产生负面的影响。先前的研究证实,永久冻土中的古代微生物带有天然抗生素抗药性。因此,Devin的团队希望研究这种抗药性在北方针叶林土壤微生物群里的普遍性。结果显示,这种抗药性广泛存在。Devin的团队利用宏基因组分析,识别了单个抗药性基因,这将增加我们对环境中累积的抗生素抗药性有了更好的理解。

全体会议

Steven Salzberg

在下午的第一个全体会议议程中,我们荣幸地迎来了约翰·霍普金斯大学计算生物学中心的Steven Salzberg教授。Salzberg教授与我们分享了他的团队最新的研究工作:通过利用长短读长结合的技术开发混合组装方法,从而得出高质量、高度连续的基因组组装。

简而言之,这一组装方法将短reads叠加而获取“super-reads”,再将其与纳米孔reads混合成为“mega-reads”,其中长reads作为scaffold。

约翰·霍普金斯大学的团队将这种新组装策略应用到普通胡桃(English Walnut Tree)(600Mb)的研究中。仅基于短读长测序,他们得到了46,168bp的contig N50;但是,在加入长reads后,该值增加到了1,324,206bp。使用纳米孔平台,该团队生成了700万reads,约是35x的人类基因组覆盖度。

在这一项目成功的基础上,更多生物可以通多这一混合组装的方法进行分析,其中包括致病真菌:多育节荚孢霉(Lomentospora prolificans)、毛芽孢子菌变种(Trichosporon mucoides)和毛芽孢子皮炎菌(Trichosporon dermatis)。有趣的是,毛芽孢子菌变种的基因组大小是预期的两倍。对此Salzberg教授的假设是:这可能是由于这种二倍体细胞菌的杂合性造成的。

Salzberg教授也介绍了他参与组装两种地球上最大的树木的基因组测序组装项目的经验;这一项目难度极高。这两种树木分别是: 巨杉(Sequoiadendron giganteum) (11 Gb)和加州红木Sequoia sempervirens) (33 Gb)。其中加州红木的测序已经完成,组装正在进行中。

混合组装算法已经与MaSuRCA系统整合。该系统和Salzberg教授实验室自主开发的如Bowtie, Tophat和Cufflinks系统一样,可免费下载。

临床应用分组研讨

Justin O’Grady

东安格利亚大学医学微生物学教授Justin O’Grady在临床与公共健康分组研讨中开场,他提出了这样一个问题:“在抗菌素耐药性(AMR)不断增加的今天,培养诊断法是否还能实现它本身的目标?”他的答案是否定的,因为培养诊断法的进程“过于缓慢”。Justin一直提倡利用纳米孔测序来提高致病菌检测的水平。

他介绍了自己最新的研究:利用MinION开发一项针对医院获得性肺炎(HAP)的快速宏基因组检测。HAP是在入院48小时后发展出的的呼吸道感染,每年会感染1.5%(200000人)的英国住院人口,有25%至50%的感染相关致死率。O’Grady教授说,现有的培养诊断法不仅有低灵敏度和低特异性的问题,还由于其进展缓慢,在病人管理方面也存在缺陷。为了解决这些问题,O’Grady教授和他的团队开发了一个宏基因组流程,其中包括人类DNA去除、病原体DNA提取/制库、MinION测序和EPI2ME分析。通过50个呼吸道感染样本的验证后,该团队仅用6个小时就实现了从样本到抗药性基因的识别 —— 这样的时间水平能够有效地提升病人管理工作。与传统的培养诊断法所必须的48小时相比,这一技术显然备受欢迎。总体上,这一宏基因组测序方法与标准的微生物检测得出的结果有92%的一致性。 后续针对抗药性的数据分析正在进行中。同时,O’Grady教授认为,有可能在所有MRSA阳性样本中检测mecA基因。

作为演讲的总结,O’Grady教授说道:“实时宏基因组技术有潜力代替肺炎的培养实验室诊断法,并在HAP病人精确管理中达到所需的快速周转时间。”

Alban Ramette

分组研讨的第二位嘉宾是伯尔尼大学生物信息学/生物统计学研究组的主任Alban Ramette博士,他的主攻方向是临床实践中高通量测序的应用。Ramette博士在演讲开始的时候指出,目前临床实践中最常用的常规病毒识别技术PCR其实忽视了许多基因畸变(如点突变和重组),这种情况只有在后续增加一项如桑格测序的附加测序才能得到解决。因此,仅采用PCR检测本身可能会导致假阳性。Ramette博士谈到了他的团队最新的研究,旨在通过纳米孔测序来解决这些问题。Ramette博士和他团队的实验开始是想了解纳米孔测序是否能让他们识别实验室培养或原样本中的肠道病毒株。该团队对RNA直接测序和RNA非直接测序(cDNA)都做出了评估。

通过cDNA测序,该团队成功的获得了覆盖度超过95%的肠道病毒基因组,其共有精确度达到了99%。Alban表示,这一测试的灵敏度水平与PCR相当。数据也显示,cDNA测序中,在测序开始后5-10分钟之后,精确度不再出现有价值的提高,尤其是当基于第一批reads的共有序列经过nanpolish后。

Alban介绍了他利用RNA直接测序得到的结果。这一数据令人激动:它仅用一次测序就提供了接近完整的RNA基因组,从而使基因组重排和原样本的定量分析变得更加简单。

作为演讲的总结,Alban说,纳米孔cDNA测序在高精确度这一点上非常出色,而RNA直接测序则提供了最快速的样本到结果时间。纳米孔技术在临床实践中的病原菌检测工作上有很大的潜力。

Claire Jenkins

最后一位分组研讨的嘉宾是英格兰公共卫生署(PHE)消化道细菌研究小组的副主任Claire Jenkins博士。她与我们分享了她在利用MinION对志贺毒性大肠杆菌(STEC)进行常规分型工作中的经验。

Jenkins博士展示了一项先导研究的成果,这一成果展示了纳米孔全基因组测序数据可以和短reads一起被整合至现有的PHE生物信息学流程中。

Jenkins博士表示,MinION的长reads比起短读长数据更能对原噬菌体进行精确表征,且短reads数据常常会造成很多假阳性结果 。精确的原噬菌体表征能为临床上具备重要意义的人畜共患病和食源性病原体的研究提供重要的线索。

作为演讲的总结,Claire说,她的团队正计划继续同时进行短读长和长读长测序,从而进行常规监测和疫情爆发调查。她的团队也在开发纳米孔测序相关流程,用于分析弧菌和耶尔森菌属,从而进行常规监测并对疫情爆发作出快速反应。

全体会议

Nanopore人类RNA研究联盟—Miten Jain和Winston Timp

来自约翰·霍普金斯大学的Winston Timp首先发言,他介绍了这一横跨英国、加拿大和欧洲、共有6个研究团队参与的多中心项目。这一项目的目标是通过纳米孔平台的RNA直接测序和cDNA测序对NA12878转录组进行测序。在他们的研究过程中,发现RNA直接测序的精确度达87%,比cDNA的86%稍高一些。但是,cDNA测序有更高的通量。该团队还发现,比起被推荐的500ng,750ng的建库起始RNA提供了更高的读数(一百万)。

来自加利福尼亚大学圣克鲁兹分校的Miten Jain随后上台,解释了他对纳米孔RNA测序深有信心的原因,其中包括:

  • 长读长带来的外显子拼接性

  • 长读长让每一个读数都能提供一个异构体预测

  • RNA读数能提供基因融合的精确测量

  • 可以对poly-A长度进行估计

  • 可以检测RNA修饰

作为演讲的总结,Miten宣布,该研究项目的初步数据已经可以通过GitHub浏览,希望能借此鼓励研究人员最大化该研究的影响、并推动其继续前进。

 

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