土壤微生物多样性与蘑菇产量相关性研究

摘要

A.sinodeliciosus是一种可以成功栽培的食用菌,但是没有任何研究报道过影响其生长获得果实体过程中相关的影响因素,为了获得生物、非生物因素,理化特征和微生物群落情况,于是作者从北疆,南疆以及浙江分别收集了五组组培土壤样品用于研究。新疆这些样品主要的区别是大小和形态,从南疆获得的样本是A.sinodeliciosus中最大的。同时发现DOC(Dissolved organic carbon)、TN(total soluble nitrogen)和C/N的比例也不是形成差异的主要原因,微生物群落和蘑菇的相互作用(MGPM)可能是导致差异的主要原因。微生物群落分析验证了“微生物和蘑菇的相互作用和形态学变化是紧密联系”的假设,其他分析结果表明较高的DOC/NH4+-N比例和NH4+-N浓度可以提高A.sinodeliciosus的产量。

背景 

蘑菇菌在生物技术方面的应用潜力在农业、生态和人类健康中发挥着重要作用。在许多国家,蘑菇是重要的食物,每年全世界食用菌产量高达250万吨,其中大部分是basidiomycetes。目前大部分可食用的basidiomycetes蘑菇是不可培养的,然而,Agaricus属Basidiomycete门中A. bisporus和A. subrufescens这两个菌却被成功培养出来了,但是产量低,生长周期长。为了当地生态环境和农民的收入,作者希望提高食用菌的产量及缩短其生长周期。

土壤是一个包含各种微生物的复杂系统,在养分循环中起着重要作用。一些研究已经报道了土壤微生物和真菌的互作作用,比如在种植冬虫夏草的土壤研究中发现了23个门的微生物,细菌和古菌的研究表明细菌和地衣有共生关系。在栽培中,蘑菇堆肥经常使用通过微生物发酵分解生物原材料获得的有机单体,放线菌和真菌是主要的纤维素分解者,到目前为止还没有关于A.sinodeliciosus土壤研究的报道,为了更好的了解土壤微生物和A. sinodeliciosus的互作关系,同时寻找缩短收获周期和增加产量的有益菌,作者对其土壤进行了微生物多样性研究。

取样

从北疆采得标号为2585和2589两组样品分别命名为A和B组,从南疆获得2590和2591两组样品分别命名为C和D组,从浙江取得样品1244命名为E组。除了C组只测了细菌,其它每组分别获得细菌和真菌各9个样品,共获得45个细菌样品和36个真菌样品进行测序分析。

研究结果

一  不同A. sinodeliciosu的土壤样品的理化特性分析

新疆的A. sinodeliciosu个体明显大于其他地方,且南疆的要大于北疆。新疆省土壤样品的DOC和TN含量均高于浙江,DOC和TN浓度、C/N在2590土壤样本的比率是最高的。然而,2591也是来自新疆南部,DOC和TN和C/N比值较低。C/N比来自浙江的1244土壤样品高于2591。试验结果表明,DOC和TN浓度和C/N比不是产生差异的主要原因。可能还是微生物互作导致的不同,因此,对不同样本土壤进行了微生物群落测序分析。

 

二 不同样品中细菌和真菌群落的丰富度和多样性分析

测序样品共获得4,438,934对细菌reads和12,190,961对真菌reads,过滤后分别获得2,498,745和1,983,159 clean tags,用97%相似性聚类分别获得26,140和5,325 OTUs,A06样品有838个OTU,是45个细菌样品中最多的;D07样品中有223个OTU,是36个真菌样品中最多的。

采用了Chao1和ACE进行物种的丰度分析,其中D样品的丰度最高,E样品的丰度最低;同时使用 Simpson和Shannon进行物种的多样性分析,样品A和D的Shannon多样性指数均高于其他样品。在真菌群落中,辛普森指数的结果与香农多样性指数表明样品A、D和E具有较高的丰富度和多样性。

 

三 细菌与真菌群落的比较分析

通过属水平的物种聚类热图分析,发现在细菌样品中A和D组能聚到一起相比B、C、E,真菌中A和D组能聚到一起相比B和E,表明不同样品间细菌和真菌群落分布存在明显差异,同时发现不同采集地的差异导致样品微生物群落的差异。根据地理位置分A和B,C和D,以及E应该分别聚类到一起,通过PCoA分析很好的验证了这个假设,在细菌中A和B,C和D聚到了一起,在真菌中A和B聚到一起,同时D和E分别单独聚到一起。

 

 

通过对样品相同方位的样品进行veen图分析,获得特有和共有的OTUs,在细菌中共有的门主要有3个:Actinobacteria、Firmicutes和Proteobacteria,其中Firmicutes在第三组样品共有的OTU中占绝对的丰度优势,有文献报道Actinobacteria、Gram-negative Proteobacteria或Gram-positive Firmicutes能够促进孢子萌发和菌丝延长,属于A. sinodeliciosu的有益菌。在真菌中,共有的门主要是Ascomycota和 Basidiomycota,去除Basidiomycota污染的干扰,可以发现Ascomycota为主要的优势菌,能够分解土壤中的多聚糖,为蘑菇的生长提供养分起着至关重要的作用。总的来说,Firmicutes或Ascomycota的菌能够在一定程度上提高蘑菇的产量。

 

四 物种注释分析

通过对细菌和真菌样品进行物种注释分别注释到28和4个门,其中Chlorofexi是ABCD组和E组差异最大的门,而这个门在碳循环中起着至关重要的作用,这个主要是不同的地理位置和不同的DOC浓度引起的。同时发现C和D组中Bacteroidetes门的丰度远高于A、B和E组,特别是在C组中。为了验证“Bacteroidetes门中的菌属于MGPM菌”这个假设,我们进一步分析了细菌的物种分布情况,Actinobacteria、Gram-negative Proteobacteria和Gram-positive Firmicutes是MGPM,而样品中Proteobacteria、 Firmicutes和Actinobacteria有非常高的丰度,这三个门的总丰度范围为19.2%-97.2%,其中只有四个样品低于50%。结果表明,这些菌能够促进蘑菇菌的生长。细菌和真菌分别注释到58和11个纲水平,分别注释到种水平的物种数有219和82个,且在属水平中A、B、C、D组和E组物种分布差异特别大。

 

讨论

 

1 通过分析发现,土壤有较低盐度和pH值时土壤中微生物的Shannon多样性指数越高。

2 为了研究A. sinodeliciosus的有利菌,把菌进行了分离出来,分成两类,第一种为C、D组丰度很高在其他组几乎没有的菌,第二种为只在B、C、D组中有的菌。共获得5个菌种;

①  发现Alcanivorax和Altererythrobacter菌在C、D组含量较高相比其他地区,而这些菌是海洋环境中重要的石油芳烃降解菌,推测新疆省的沙漠以前是被石油污染后高盐度和高PH值的湖。

②  在C、D组中检测出关于氮循环的细菌,这些细菌以CO2为碳源,利用亚硝酸盐或甲酸作为能源,可以减少土壤中硝酸盐或者亚硝酸盐的含量。这些微生物的发现表明土壤样品中存在氮循环。

③  在样品D中发现了大量的硫代谢相关的微生物,新疆省土壤中硫酸盐含量也很高,其他样品中没有发现与硫代谢有关的细菌。

④  在浙江酸性和新疆碱性土壤中有着不同分解纤维素的菌,这些菌与蘑菇是互利共生的。

⑤  在南疆菌群中发现大量的Promicromonospora,在北疆中含量较低,而浙江样品中没有此类菌,这类菌能分泌生长激素调节蘑菇的生长,这也是南疆蘑菇大于其他地区的原因。     

通过RDA分析研究了环境因子DOC、C/N、TN、TIC、NH4+-N、NO3−-N等在样品中的影响,高C/N比和NH4+-N浓度对Agaricus菌丝生长有促进作用。减少土壤中NO3 – N浓度可以提高C/N比从而提高Agaricus菌丝生长。同时发现较高的 DOC/NH4+-N比例和NH4+-N浓度可以提高A. sinodeliciosus的产量,通过RDA分析可以指导A. sinodeliciosus的培育。

总结

通过对不同地区A. sinodeliciosus培养土壤进行16S rRNA和ITS1进行测序分析发现,不同地区样品中有不同的有益菌。Promicromonospora菌可能是影响A. sinodeliciosus果实体的主要原因,同时通过调整DOC/NH4+-N比例和NH4+-N浓度可以提高A.sinodeliciosus的产量,为后期A. sinodeliciosus的大规模栽培奠定基础。


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