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生态样本宏基因组测序样品制备及DNA提取方法

普通土壤

  • 取样方法

根据研究目的确定采样范围,取样器具要事先消毒灭菌处理。采样时应去除表面浮土,使用乙醇火烧的铲子挖取地下5~20cm的土层,去除可见杂质后,土壤过2mm筛网。每个样品从3个或以上采样点采集并混合,去除杂质后,每5~10g分为一份,保存于无菌离心管中,置于0℃以下运回实验室,用于抽提DNA。如不能马上实验,置于-80℃保存。

  • 提取方法

手工提取参考文献:Clegg C D, Ritz K, Griffiths B S. Direct extraction of microbial community DNA fromhumified upland soils [J]. Letters in Applied Microbiology, 1997, 25(1):30-33.
推荐试剂盒:MoBioPowerSoil®DNA Isolation Kit

根际土壤

  • 取样方法

取样器具要事先消毒灭菌处理,采集20cm深的根际土壤置于50mL的无菌管里,迅速放在液氮里储存,用20目的筛子过筛,去除植物根、动物残骸以及其他杂质后分装到无菌离心管里,每管3~5g,密封后立即放于-80℃储存备用。

  • 提取方法

手提方法可参考:
[1] Niemi R M, Heiskanen I, Wallenius K, et al.Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGEanalysis of bacterial consortia [J]. Journal of Microbiological Methods, 2001,45(3):155-165.
[2] Wang J, Wu G, Li W, et al. A DNA extraction method used for evaluation of diversityof the plant rhizosphere microbial community[J]. 2013.
推荐试剂盒:MoBio PowerSoil®DNA Isolation Kit 或 MoBio PowerSoil High-Throughput DNA Isolation Kit

水体

  • 取样方法

根据研究目的确定采样深度和范围,采集好的水样需要通过滤膜进行过滤,可以根据水样的浑浊程度选择相应孔径的滤膜,之后置于-80℃保存备用。
清亮水样:可选择小孔径的滤膜,一般选0.22μm 或0.45μm 的滤膜,过滤水样体积大于10L;
浑浊水样:过滤前静置分离悬浮颗粒,也可以用大孔径的滤膜预过滤一遍,再用小孔径的滤膜进行过滤。

  • 提取方法

手提DNA可参考文献:
[1] Arumugam R, Chan X Y, Yin W F, et al. Metagenomic analysis of Microbial Diversity of Tropical Sea Water of Georgetown Coast, Malaysia [J]. Life Science Journal,2013, 10(3).
[2] Shi P,Jia S, Zhang X X, et al. Metagenomic insights into chlorination effects onmicrobial antibiotic resistance in drinking water [J]. Water Research, 2013,47(1): 111-120.
推荐试剂盒:PowerWater®Sterivex ™ DNA Isolation Kit (MoBio, USA)

活性污泥及海洋沉积物

  • 取样方法

活性污泥:从曝气池中取25mL悬浮的活性污泥样本放入无RNA 酶的管中,迅速放入液氮并运送到实验室提取DNA;

地表沉积物:取距地表0-10cm 的地表沉积物,每个位点取1-2kg的沉积物装入消毒聚乙烯塑料袋中,立刻置于0℃运到实验室进行DNA提取。

  • 提取方法

推荐试剂盒:
FastDNA®Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, USA)或UltraClean®Mega Soil DNA Isolation kit(MoBio,USA)进行提取并利用PowerClean® DNA Clean-Up kit (MoBio,USA)进行纯化。
注:每个样本提取两次并将提取好的DNA混为一管以减少DNA提取的潜在偏好性,参考Cai L, Yu K, Yang Y, et al. Metagenomic exploration reveals highlevels of microbial arsenic metabolism genes in activated sludge and coastalsediments [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2013, 97(21): 9579-9588.

植物内生菌

  • 取样方法

用流水冲洗植物根样本表面并摘掉小侧根,粘根土壤粒要进行化学消毒(95%的次氯酸钠2min),用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈摇晃,物理去除细菌。之后用手术刀片划开根部组织以释放内生菌,用无菌玻璃珠在9%的生理盐水中振荡,在30℃的条件下振荡4h以分离内生菌,之后用5μm滤膜过滤,15000r,4℃离心收集沉淀并置于液氮中保存。

  • 提取方法

内生真菌样本DNA提取参考文献:
Sessitsch A, Hardoim P, Döring J, et al. Functional characteristics of an endophytecommunity colonizing rice roots as revealed by metagenomic analysis [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2012, 25(1): 28-36.
内生细菌样本DNA提取方法参考文献:
Shi Y W, Yang H, Zhang T, et al. Illumina-based analysis of endophytic bacterialdiversity and space-time dynamics in sugar beet on the north slope of Tianshanmountain [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2014, 98(14): 6375-6385.

空气

  • 取样方法

采样使用的器具要每天进行更换,并且使用75%的酒精进行洗涤;
1.收集目标区域的空气微颗粒,采用不同孔径大小的无菌滤膜进行目的颗粒的筛选,如果不分颗粒小大,可直接选取最小孔径的无菌滤膜进行过滤,以保证空气微生物最大程度上被过滤下来;
2.将过滤好的无菌滤膜迅速密封,置于-80℃条件下进行保存;
3.截取适当大小的滤膜放在含有1×PBS缓冲液的50mL离心管中,于4℃条件下,用200g加速度离心3h;

4.最后温和漩涡处理,使用0.2μm的Supor200 PES Membrane Disc Filter过滤重悬液后待提取。

  • 提取方法

手提可参考文献:
[1] Jiang W, Liang P, Wang B, et al. Optimized DNA extraction and metagenomic sequencingof airborne microbial communities.[J]. Nature Protocols, 2015, 10(5):768-79.
[2] Yooseph S, Andrews-Pfannkoch C, Tenney A, et al. A Metagenomic Framework for the Studyof Airborne Microbial Communities [J]. Plos One, 2013, 8(12): e81862;
推荐试剂盒:
MoBioPowerSoil DNA isolation kit.

物体表面

  • 取样方法

将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中,加入PBS缓冲液后进行振荡,使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,之后直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。

  • 提取方法

提取具体流程可参考文献:
HewittK M, Gerba C P, Maxwell S L, et al. Office space bacterial abundance and diversityin three metropolitan areas [J]. 2012.

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